BRCA1的过表达减弱了易瑞沙、吉非替尼引起的DNA损伤

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所属分类:吉非替尼
摘要

   易瑞沙 /吉非替尼是一种口服活性抗癌剂,通过阻断表皮生长因子受体 (EGFR) 讯号通路来抑制不受控制的细胞增殖。各种体外和体内研究表明,乳腺癌易感基因 1 (BRCA1) 的表达上调与化学疗法耐受药物和化学疗法后生存几率减少有关。在本研究中,使用吉非替尼高敏感性细

易瑞沙/吉非替尼是一种口服活性抗癌剂,通过阻断表皮生长因子受体 (EGFR) 讯号通路来抑制不受控制的细胞增殖。各种体外和体内研究表明,乳腺癌易感基因 1 (BRCA1) 的表达上调与化学疗法耐受药物和化学疗法后生存几率减少有关。在本研究中,使用吉非替尼高敏感性细胞系 PC-9 来研究 BRCA1 表达对 PC-9 细胞对吉非替尼敏感性的影响。PC-9 细胞被 BRCA-1 (HA-tagged) 稳定转染。用吉非替尼处置转染和未转染的PC-9细胞,通过蛋白质印迹检测磷酸化的γH2AX以确定DNA损伤。吉非替尼医治后,PC-9 细胞增殖抑制,PC-9-pcDNA3。1细胞和BRCA1转染的PC-9细胞进行了测定。此外,还进行了彗星试验以确定吉非替尼引发起的 DNA 损伤。吉夫替尼医治 6 小时、12 小时和 24 小时显着延长了磷酸化 γH2AX 的细胞表达。在吉非替尼医治下,BRCA-1过表达的PC-9细胞对增殖的抑制作用明显低于未转染的PC-9细胞,表明BRCA1的过表达在减弱PC-9的敏感性中起作用细胞到吉非替尼。彗星试验显示,BRCA1转染的细胞显示出较短的彗尾,表明BRCA1的过表达减弱了吉非替尼引发起的DNA损伤。BRCA1的过表达降低了DNA损伤,增强了DNA修复机制。

BRCA1的过表达减弱了易瑞沙、吉非替尼引起的DNA损伤

BRCA1的过表达减弱了易瑞沙、吉非替尼引起的DNA损伤

据报道,肺癌是恶性肿瘤相关去世的主要原理,2012 年有 159 万人去世。作为肺癌的一种,NSCLC 占所有肺癌病例的 80% 以上,预后较差,生存期较差。已在各种恶性肿瘤类别中检查到 EGFR 的激活和过表达,并建议其促进肿瘤发生、恶性肿瘤进展和转移扩散。因此,EGFR是恶性肿瘤医治的重要靶点之一,包括阻断EGFR活化的小分子TKI易瑞沙/吉非替尼。研究表明,吉非替尼医治减少了 pEGFR、pAKT 和 pERK 的水平,其中涉及 DNA 合成和 DNA 修复。由 EGFR 介导的 DNA 修复机制显示需要与 DNA 蛋白激酶 (DNA-PKcs) 的催化亚基结合,这些亚基与 EGFR 形成复合物,调节非同源末端连接以修复 DNA 链断裂。吉非替尼医治能够抑制 EGFR 的激活,并阻断 DNA-PKcs 和 EGFR 之间的互相作用。

BRCA1的过表达减弱了易瑞沙、吉非替尼引起的DNA损伤

pγH2AX 的存在表明 DNA 损伤,包括双链断裂和单链损伤。DNA 损伤可能是由外源性要素(如辐射)或内源性要素(如致癌突变和正常的 DNA 复制)引发起的。对 A549 和 H1299 细胞的研究表明,恶性肿瘤药物易瑞沙/吉非替尼医治会干扰 DNA 修复机制,因此会增加 DSBs 的存在,从而诱导 pγH2AX 的积累。我们的研究还证实了在 PC-9 细胞中响应吉非替尼的 pγH2AX 细胞水平延长。尽管我们研究中的 PC-9 细胞没有暴露于辐射以产生 DNA 损伤,但我们模型中 DNA 损伤的主要来源是正常的 DNA 复制。积累的 pγH2AX 对于招募参与 DNA 修复的各种复合物(包括 BRCA1)至关重要。

作为DNA修复的重要机制,同源重组(HR)需要BRCA1调控转录,激活细胞周期检测点,从而修复DNA损伤。BRCA1 在 DNA 修复中的重要作用涉及 BRCA1 与各种细胞蛋白之间的互相作用,例如 BARD1、PALB 和 RAD51。在我们的研究中,我们检查到 pRAD51 的细胞水平延长,以响应由易瑞沙/吉非替尼引发起的 DNA 损伤。Scully 等人在核病灶中检查到 BRCA1 和 RAD51 的共定位。BRCA1 不是 BRCA1 和 RAD51 之间的直接互相作用,而是招募 BRCA2,这有助于将 RAD51 加载到 DNA 损伤位点。在这个复合物中,BRCA1 在识别 DSB 位点中发挥作用,因为 BRCA1 的敲低显示降低了 DNA 链上 RAD51 病灶的形成。该复合物的一个重要结构域是 BRCA1 的卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋结构域的错义突变已被证明会破坏 BRCA1 和 PALB2 之间的互相作用,从而减少 HR 功效 。BRCA1识别DNA损伤位点后,募集的RAD51是直接促进DNA修复的蛋白质。Hela 细胞中 RAD51C 的消耗揭示了较低的核 RAD51 水平,表明除了 BRCA2 的参与外,RAD51C 是促进 RAD51 进入细胞核的另一种重要蛋白质。因此,在本研究中,BRCA1 的过表达显着延长了 pRAD51,并对吉非替尼有初期反应。然而,在 BRCA1 过表达的 PC-9 细胞中,吉非替尼医治 12 小时后 pRAD51 的细胞水平开始减少。这可能是由于那些促进 RAD51 进入细胞核的蛋白质的活性减少,导致 DNA 修复降低。这也解释了在 BRCA1 过表达的 PC-9 细胞中,吉非替尼处置 12 小时后 pγH2AX 延长,以及吉非替尼处置 24 小时后细胞生长抑制延长。尽管介导了 RAD51 对 DNA 链侵袭的活性,但 BRCA1 还能够与其他蛋白质互相作用,包括用于 S 期检测点的 BACH1 和用于泛素化染色质靶向的 Rap80,这也起到调节细胞增殖的作用。

BRCA1 在 DNA 修复以及细胞周期调节中的作用已在各种恶性肿瘤类别中进行了研究。在来自乳腺癌和卵巢癌的细胞系中,BRCA1 的敲低促进了恶性细胞的生长,而将 BRCA1 引入细胞中可抑制肿瘤细胞的增殖 。这些结果表明 BRCA1 在乳腺癌和卵巢癌中的生长抑制活性。然而,BRCA1 在 NSCLC 中表现出相反的作用。在我们的研究中,BRCA1 的过表达减弱了易瑞沙/吉非替尼诱导的细胞生长抑制,尽管随着吉非替尼暴露的增加,细胞生长抑制延长。

据报道,44%的NSCLC表现出BRCA1 mRNA和BRCA1蛋白表达减少。此外,一项针对 BRCA1 缺陷型 NSCLC 亚组的研究揭示了奥拉帕尼的有效医治方式,该药品通过靶向多聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP) 抑制 NSCLC 的进展。奥拉帕尼的一项 IB 期研究指出,具有高表达水平 BRCA1 的 EGFR 突变患病者在使用 TKI(如吉非替尼)医治时表现出较短的无进展生存期。这表明过表达的 BRCA1 减少了 TKI 医治的有效性,这与我们的研究结果一致。我们的研究表明,BRCA1 的过表达显着减少了 DNA 损伤,并减弱了吉非替尼诱导的细胞生长抑制。

在 PC-9 细胞系中评估了易瑞沙/吉非替尼对细胞生长抑制和 DNA 损伤的影响。吉非替尼医治诱导的 DNA 损伤以及细胞生长抑制因 BRCA1 的过表达而显着减弱,尽管减弱不会增加超过 24 小时。我们的研究结果揭示了 BRCA1 在响应抗肿瘤 TKI 药品的 NSCLC 细胞存活中的重要作用。因此,我们认为 BRCA1 能够作为药品开发的靶点。【微信:yaodaoyaofang】扫描下方二维码了解更多:

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